Định lượng protein đo quang phổ màu
Protein thường là hỗn hợp của protein. Xét nghiệm đo màu được dựa trên thành phần protein: axit amin (ví dụ, tyrosine, serine) phản ứng với một nhóm sắc tố bổ sung hoặc thuốc nhuộm để tạo ra một chất liệu màu. Nồng độ của vật liệu màu có liên quan trực tiếp đến số lượng axit amin mà protein phản ứng, qua đó phản ánh nồng độ protein.
Phương pháp đo màu
Có một số phương pháp như BCA, Bradford và Lowry.
Phương pháp Lowry: Dựa trên phản ứng Biuret sớm nhất và được cải thiện. Protein phản ứng với Cu2 để tạo ra phản ứng màu xanh. Tuy nhiên, phương pháp Lowry nhạy hơn Biuret. Nhược điểm là nhu cầu tuần tự thêm một số thuốc thử khác nhau; phản ứng mất một thời gian dài; dễ bị các chất phi protein; các protein có chứa EDTA, Triton x-100 và amoniac sulfate không phù hợp với phương pháp này.
Xét nghiệm axit Bicinchoniinine: Đây là một xét nghiệm protein mới hơn, nhạy cảm hơn. Protein được phân tích phản ứng với Cu2 trong dung dịch kiềm để tạo Cu, tạo thành một chelate với BCA để tạo thành một hợp chất màu tím với một đỉnh hấp thụ ở 562 nm. Mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ của hợp chất này và protein là mạnh, và hợp chất được hình thành sau khi phản ứng rất ổn định. So với phương pháp Lowry, thao tác rất đơn giản và độ nhạy cao. Tuy nhiên, tương tự như phương pháp Lowry, nó dễ bị nhiễu với protein và chất tẩy rửa.
Phương pháp Bradford: Nguyên tắc của phương pháp này là protein phản ứng với Coomassie Brilliant Blue để tạo ra hợp chất có màu hấp thụ ở 595 nm. Tính năng lớn nhất của nó là độ nhạy của nó, gấp 2 lần so với Lowry và BCA. Nó đơn giản và nhanh hơn. Nó chỉ đòi hỏi một loại thuốc thử phản ứng. Hợp chất có thể ổn định trong 1 giờ để tạo thuận lợi cho kết quả; Can thiệp với Lowry, BCA phản ứng với các chất khử (như DTT, mercaptoethanol) tương thích. Tuy nhiên, nó vẫn còn nhạy cảm với chất tẩy rửa. Hạn chế chính là các tiêu chuẩn khác nhau có thể dẫn đến sự khác biệt lớn trong kết quả của cùng một mẫu và không có kết quả tương đương.
Một số nhà nghiên cứu tiếp xúc với các phép đo đo màu lần đầu tiên có thể bị nhầm lẫn bởi kết quả của các phép thử đo màu khác nhau. Những loại phương pháp nào bạn tin là bị lẫn lộn? Do thực tế là các nhóm phản ứng theo những cách khác nhau và các nhóm sắc tố không giống nhau, một số phương pháp được sử dụng đồng thời để làm cho nồng độ mẫu của cùng một mẫu không phù hợp. Ví dụ, Keller et al. kiểm tra protein trong sữa mẹ và thấy rằng nồng độ được đo bởi Lowry và BCA cao hơn đáng kể so với Bradford. Sự khác biệt là đáng kể. Ngay cả khi cùng một mẫu được xác định, mẫu chuẩn được chọn bởi cùng một phương pháp đo màu không phù hợp, và nồng độ sau khi thử nghiệm cũng không phù hợp. Ví dụ, sử dụng Lowry để kiểm tra protein trong tế bào đồng nhất, sử dụng BSA như một tiêu chuẩn, với nồng độ 1,34 mg / ml, và globulin là một tiêu chuẩn với nồng độ 2,64 mg / ml. Do đó, trước khi chọn phương pháp đo màu, tốt nhất là nên tham khảo thành phần hóa học của mẫu thử và tìm protein tiêu chuẩn tương tự về mặt hóa học như một tiêu chuẩn. Ngoài ra, phương pháp đo màu để định lượng protein thường gây ra các vấn đề trong đó giá trị độ hấp thụ của mẫu quá thấp, dẫn đến sự khác biệt lớn giữa nồng độ mẫu được đo và nồng độ thực tế. Vấn đề chính là màu sắc của phần quan trọng của máy quang phổ 1011, cuvette, có chu kỳ bán rã nhất định, vì vậy mỗi phương pháp đo màu liệt kê thời gian thử nghiệm phản ứng. Tất cả các mẫu (bao gồm cả mẫu chuẩn) phải được kiểm tra trong thời gian này. Nếu thời gian quá dài, giá trị độ hấp thụ thu được trở nên nhỏ hơn và giá trị nồng độ được chuyển đổi giảm. Ngoài ra, nhiệt độ phản ứng, giá trị pH của dung dịch, vv là tất cả các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thí nghiệm. Ngoài ra, điều rất quan trọng là sử dụng phép đo màu nhựa. Tránh sử dụng cuvet làm bằng thạch anh hoặc thủy tinh vì màu sau phản ứng sẽ làm cho thạch anh hoặc thủy tinh bị nhuộm màu, dẫn đến độ hấp thụ không chính xác của mẫu.
Công ty chuyên bán máy quang phổ , chào đón khách hàng có nhu cầu tư vấn và mua hàng, chúng tôi sẽ cung cấp cho bạn dịch vụ chân thành và chất lượng sản phẩm, cũng như giá thấp hơn.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com